Réalisation avec les étudiants en 2ème année de bts biotechnologies

MISE AU POINT DU TP DE CO-FERMENTATION DU TOPINAMBOUR ET DU PAIN POUR AUGMENTER LE RENDEMENT DE PRODUCTION EN Éthanol

1. OBJECTIFS

Face aux soucis de rendement de production en éthanol que nous avons rencontré ces dernières années à partir du pain recyclé du lycée, nous avons décidé d’explorer la possibilité d’introduire une autre source de carbone qui nous permettra d’augmenter notre rendement de production.

Nous avons également envisagé le traitement des déchets végétaux, pour produire du méthane équivalent GPL, idée qui ne sera réalisable que dans 2 à 3 ans, le temps de fabriquer un système de méthanisation de la biomasse.

Nous avons donc décidé d’utiliser une autre source de carbone, en gardant à l’esprit les risques de ce type de production :

- Un risque de concurrence avec les productions alimentaires au profit de la production d’énergie. Le modèle développé par l'INRA permet de calculer qu'il y aura compétition entre les cultures alimentaires et "énergétiques" dès 2006 et ce, avant même que toutes les surfaces de jachère soient réquisitionnées. D’ailleurs, remplir le réservoir d’un 4x4 avec 94,5 litres d’éthanol pur nécessite environ 204 kg de maïs, soit suffisamment de calories pour nourrir une personne pendant un an, selon une étude publiée par la revue américaine Foreign Affairs ;

- Une hausse du prix des matières premières déjà bien amorcée. Depuis le début de l’année 2007, le prix du blé a augmenté de 61,3%, le maïs de 53,9% et les oléagineux de 20,3%, selon l’Insee ;

- Un risque de pénurie de denrées alimentaires dans les pays les plus pauvres. En effet, l’usage de plus en plus fréquent de l’éthanol comme biocarburant risquerait de menacer l’alimentation des 2,7 milliards de personnes dans le monde qui vivent avec moins de 2 dollars par jour ;

- Un risque environnemental si la production devient intensive. Avec la consommation de grandes quantités d'eau, la pollution des eaux par l'usage abusif d'engrais et de pesticides et l’épuisement des sols par une surexploitation des terres ;

- Le risque d’accentuer les problèmes de déforestation déjà constaté au Brésil pour la production de canne à sucre (filière alcool) et en Indonésie, certains pays d’Afrique, d’Asie et d’Amérique latine pour la plantation de palmier à huile (filière huile) ;

pour ou contre les agrocarburants?

Pour toutes ces raisons, nous nous somme intéressé au topinambour un tubercule originaire du Canada et ramené en France par les colons en 1613. Ce tubercule a était utilisé en tant que légume de rationnement lors de la seconde guerre mondiale et sous sa forme fourragère, il a permis de nourrir le bétail. A l’heure actuelle, grâce à ces fleurs ressemblant à celle du tournesol et sa fleuraison automnale, le topinambour est davantage utilisé dans les massifs floraux et sa consommation reste marginale.

Rustique, il est facile à cultiver même sur des sols les plus pauvres, il n'est pas sensible aux maladies, ni aux prédateurs, ni au froid tant que le tubercule reste dans la terre et il ne nécessite pas d’arrosage.

Riche en inuline, un polysaccharides caractérisé par une colonne vertébrale de fructose et un glucose terminal. Il n’est pas assimilable par notre organisme et sert plutôt de fibre alimentaire facilitant le transit intestinal.

TABLEAU DE COMPOSITION pour 100g
topinambour			pain		Pomme de terre
Protéines	2.5		Protéines	9	Protéines	2
Lipides	trace		Lipides	2	Lipides	trace
Glucides avec inuline	8.00	16	Glucides	50	Glucides	21
Glucides assimilables	4.00

Tout comme l’amidon contenu dans le pain, l’inuline peut être directement hydrolysée et fermentée en alcool (métabolite primaire) avec un bon rendement par certaines espèces de levures telles que Kluyveromyces fragilis et marxianus, Candida macedoniensis, Torulopsis colliculosa, etc.

C’est pour toutes ces raisons que nous souhaitons l’intégrer dans le projet éthanol en assurant sa culture au lycée avec la fleuraison des espaces verts et sa récolte à l’automne pour la fermentation alcoolique une fois qu’elle sera mise au point par vos soins.

A vous de jouer.

2. LES OUTILS DE TRAVAIL

2.1. Les différentes sources de carbone pure

· Inuline

· Amidon

2.2. Les différentes souches de levure

· Saccharomyces cerevisiae

· Kluveromyces marxianus

· Kluveromyces lactis

· Torulopsis rubra

2.3. La biomasse à transformer

· le pain récupéré au self

· le topinambour qui à terme devrait fleurir les espaces verts du lycée

3. LES AXES DE RECHERCHE

3.1. Examen macroscopique et microscopique des différentes souches de levures

3.1.1. Examen macroscopique sur gélose Sabouraud

Réaliser l’examen et Compléter le tableau.

3.1.2. Examen microscopique : EF

Réaliser l’examen et Compléter le tableau

3.2. Test d’assimilation de l’amidon et de l’inuline par différentes souches de levures

3.2.1. Préparation

· Mélanger la base agar-agar en surfusion avec du milieu AUX 10 X

· Ajouter l’inuline ou l’amidon de façon à obtenir une concentration en sucre de 1% dans 15 mL de gélose en surfusion

· Couler et laisser sécher la gélose

3.2.2. Ensemencement

· Faire une strie de 10µL de chaque souches avec une anse en plastique stérile calibrée de 10 µL et sur chacune des boîtes

· Réaliser une matrice au préalable

3.2.3. Lecture et exploitation des résultats

· Réaliser un dessin d’observation des boîtes

· Conclure

3.3. Suivi de croissance des différentes souches de levures en présence de différentes sources de carbone et dans des conditions physiologiques variables

3.3.1. Préparation

Vous disposez d’un erlen de milieu neuf pour auxanogramme : volume = 20 mL

Ajouter l’inuline ou l’amidon de façon à obtenir une concentration en sucre de 1% dans le volume final de milieu
Mesurer l’absorbance à 600nm de la préculture et calculer N sachant que : 1 UA = 2.10⁷ UFC/mL pour les levures
Ensemencer le milieu neuf à 10% avec la préculture
Veiller à pré-incuber le levain et le milieu neuf à la même température avant de lancer la croissance
Homogénéiser et lancer le chronomètre (temps t = 0)
Vérifier que le pH se situe bien entre 5 et 6 à l’aide de papier pH

3.3.2. Suivi de croissance

Lecture d’absorbance toutes les 20 minutes à 600 nm

Conditions physiologiques testées :

Saccharomyces cerevisiae

Kluveromyces marxianus

Kluveromyces lactis

Torulopsis rubra

K. marxianus et

S. cerevisiae

Ensemble les souches de levures

amidon

T°30°C

amidon

T°30°C

amidon

T°30°C

amidon

T°30°C

inuline et amidon

T°30°C

inuline et amidon

T°30°C

inuline

T°30°C

inuline

T°30°C

inuline

T°30°C

inuline

T°30°C

inuline et amidon

T°32°C

inuline et amidon

T°ambiante

amidon

T°ambiante

amidon

T°ambiante

amidon

T°ambiante

amidon

T°ambiante

inuline et amidon

T°ambiante

Inuline

T°ambiante

Inuline

T°ambiante

Inuline

T°ambiante

Inuline

T°ambiante

3.3.3. Tracés et exploitation des résultats (Cf. TP’s suivi de croissance)

Reporter les résultats d’absorbance dans un tableau
Tracer la courbe de croissance lnA_600nm = f(t) sur papier semi-log
Dégager, nommer et analyser les différentes phases de la croissance.
Déterminer graphiquement et Calculer les paramètres d’état de la croissance : m_x expo et G
Sur Igor faire la synthèse des différents suivi de croissance afin de conclure sur les paramètres optimaux de croissance des levures étudiées (Cf. TP Influence des paramètres physiologiques sur la croissance)

3.4. Vérifier la pureté de la souche

· Faire un isolement de toutes les souches sur milieu Sabouraud en fin de suivi de croissance

3.5. Dosage de l’inuline dans le jus de topinambour

Doser l’inuline dans le jus de topinambour pour vérifier les données théoriques données en introduction

3.5.1. Préparation de la boîte de dosage

· A partir de la lecture d’absorbance à 600 nm réalisée en 3.3.1. sur la culture de Kluveromyces marxianus et de la déduction de la concentration cellulaire N de cette culture, sachant qu’une unité d’absorbance à 600nm correspond à 2.10⁷ UFC/mL.

· Calculer la dilution nécessaire à effectuer pour obtenir une suspension-inoculum permettant d’ensemencer le flacon de gélose Mueller-Hinton à une concentration cellulaire finale de 10⁵ UFC/mL dans la gélose avec un volume maximal de 5mL de cette suspension-inoculum.

· Ensemencer alors le flacon de gélose avec le volume (précédemment calculé) de suspension-inoculum, homogénéiser (sans provoquer la formation de bulles) et couler immédiatement dans la boîte carrée.

· Laisser solidifier la gélose.

3.5.2. Préparation du jus de topinamabour

· A l’aide de la centrifugeuse mise à votre disposition extraire le jus de topinamabour pour le dosage de l’inuline

3.5.3. Préparation de la boîte de dosage

· Préparer une gamme d’étalonnage, à partir de la solution d’inuline I1 à 10 g/L, en eau physiologique stérile : I2 = 8 g/L, I3 = 6 g/L, I4= 4 g/L, I5= 2 g/L. Volume final 500 µL.

· Sachant que l’inuline représente près de 8% dans le topinambour. Diluer, le jus de topinambour en eau physiologique stérile de façon à obtenir 2 essais en milieu de gamme.

· Préparer une matrice de dépôts (à rendre), pour disposer 16 disques de papier (doubler chaque essai).

· Déposer 10 µL de chaque solution selon le schéma fourni.

· Charger les disques sur le couvercle retourné avant leur dépôt sur la gélose.

· Laisser prédiffuser les solutions déposées pendant 30 minutes à la température du laboratoire, boîte à l’endroit.

· Retourner la boîte et incuber à 30°C jusqu’au lendemain.

3.5.4. Lecture et exploitation des résultats

Photographier et Réaliser un dessin d’observation des boîtes
Mesurer les diamètres de culture autour de chaque disque
Récapituler ces résultats dans un tableau.
Tracer la courbe des variations du diamètre moyen en fonction du logarithme décimal de la concentration en antibiotique sur papier millimétré ou Igor.
Exploiter graphiquement les résultats des inconnues, en justifiant brièvement vos choix.
Calculer la concentration en inuline dans le jus de topinamabour.
Conclure sur la véracité des données en introduction.

3.6. Selon les résultats obtenus mise en route de différentes fermentations

3.6.1. Fermentation du pain recyclé

Fort de quelques années d’expérimentation, relancer une fermentation identique à celle lancé avec les secondes BLP de l’an passé : http://decaz.ecomarathon.free.fr
A la différence près, que cette année il est impératif de pouvoir calculer le rendement de production en fin après distillation.

Pour cela, consigner l’ensemble des informations suivantes : poids de pain récupéré au self, poids de mie récupérée pour la fermentation (sachant que la croûte contient des inhibiteurs de fermentation), volume de milieu, volume du broyat, volume de culture de levure, volume de filtrat, volume d’éthanol pur.

3.6.2. Fermentation du topinambour

Broyage et du topinambour et obtention d’un jus utilisable pour la fermentation
Préparation du levain
Mélange
Fermentation
Consigner l’ensemble des informations suivantes : poids de topinambour, poids ou volume de jus obtenu, volume de milieu, volume de culture de levure, volume de filtrat, volume d’éthanol pur

3.6.3. Co-Fermentation du pain et du topinambour : topi-pain

Combinaison des deux protocoles précédents

3.7. Suivi de l’augmentation du taux d’éthanol dans le mou de fermentation

Comme l’équation de dégradation de l’amidon est la suivante :

Nous pouvons envisager un suivi de la production d’éthanol de deux façon :

Dosage alcool avec un kit (voir principe sur fiche dosage éthanol par méthode UV)
Suivi taux CO2 libéré

3.8. Typage et conservation des souches « précieuses »

3.8.1. Choix de la composition du levain

En fonction des résultats obtenus précédemment, en concertation avec le reste du groupe et de l’enseignant procéder au choix des souches de levures qui composeront le levain de fermentation du combiné topi-pain

3.8.2. Typage des souches du levain

Grâce à l’étude des caractères biochimiques (Cf. TP Levures) réaliser un profil biochimique des différentes souches du levain

3.8.3. Conservation des souches dites précieuses

Conserver les souches du levain grâce à une technique de conservation de votre choix ( Cf.TP Conservation des souches)

4. LA Synthèse DES Résultats

4.1. Capacité des différentes souches à utiliser l’amidon et l’inuline

4.2. Souches remportant les meilleurs résultats de croissance

4.3. Les paramètres physiologiques optimaux de croissance

4.4. Antagonismes et synergies entre les différentes souches lors de co-fermentation

4.5. Rendement de production en éthanol

Test d'assimilation de l'amidon et de l'inuline par les différentes souches

Allumage du bec bunsen pour créer une zone stérile pour manipuler à l'abris de toute contamination

Dépôt d'une strie de 10µL de chaque suspension sur les deux boîtes de milieu Auxanogramme + inuline ou amidon avec une anse calibrée, incubation 48h à 30°C

Toutes des souches de levures testées sont capables d'assimiler l'Inuline et l'Amidon comme seules sources de carbone

Donc, elles devraient être capables de se développer plus ou moins bien dans le pain contenant de l'amidon et le topinambour contenant de l'inuline

Suivi de croissance des différentes souches de levure en présence de différentes sources de carbone et dans des conditions physiologiques variables

Suivi de croissance des levures en présence d'inuline ou d'amidon dans différentes conditions physiologiques

Comptage des levures en cellule de Malassez : comptage sur 4 rectangle à chaque angle de la cellule

Tracé du suivi de croissance Absorbance = f (temps) sur papier semi logarithmique

le suivi de croissance de toutes les souches en présence d'amidon et d'inuline à différentes température nous renseigne sur la température la plus favorable au développement des levures, ici il s'agit de la température 30°C

Présence d'un seul type de colonie sur chaque isolement donc les différentes souches sont pures

Préparation de la boîte de dosage de l'inuline dans le jus de Topinambour

Imprégnation des disques avec 10µL de chaque dilution de la solution d'inuline à 1%

Malheureusement, ce test n'a pas donné des résultats concluants : absence de pousse de Kluveromyces marxianus et développement des microorganismes présents dans le jus de topinambour non filtré avant dépôt.

Récupération uniquement de la mie de pain car la croûte contient des substances inhibitrices de la fermentation

Lavage des tubercules de Topinambour pour éviter l'introduction de bactéries du sol dans le mou de fermentation

Pesée des tubercules de Topinambour en vu du calcul du rendement de production en éthanol

Choix des différentes fermentations à mener en fonction des résultats obtenus au cours de la séance

1141 g de mie de pain récupérée et 1944 g de tubercules de topinambour broyés soit 1.75 litres de jus de topinambour

2296 g de mie de pain récupérée et 2220 g de tubercules de topinambour broyés soit 2.1 litres de jus de topinambour

Mélange des différents jus pain et/ou topinambour et levain de levure en fonction des résultats les plus concluant obtenus lors des suivis de croissance

Incubation à l'étuve à 30°C la température optimale de développement des levures

Suivi de l'augmentation du taux d'alcool dans les moûts de fermentation : prélèvement d'échantillons de moût à intervalles réguliers pour doser l'éthanol

Auxanogramme : test d'assimilation de différentes sources de carbone par voie oxydative

la présence d'une culture traduit la capacité de la souche à assimiler la source de carbone par voie oxydative

à gauche: Zymogramme : test d'assimilation de différentes sources de carbone par voie fermentative

le virage de l'indicateur coloré du bleu au jaune traduit la capacité de la souche à assimiler la source de carbone par voie fermentative

à droite : test de réduction du TTC, l'apparition d'un anneau rose signifie que le TTC est réduit par la souche de levure étudiée

Antagonismes et synergies entre les différentes souches lors de co-fermentation

PRODUCTION DE L'ETHANOL PAR CO-FERMENTATION TOPIPAIN avec les ELEVES DE SECONDE BLP

Lavage des tubercules pour les débarrasser de la terre qui apporte des germes néfastes à une bonne fermentation alcoolique

Récupération des germes de tubercule de topinambour pour les planter dans les espaces verts du lycée

Broyage du topinambour et obtention d'un jus riche en inuline substrat de la fermentation alcoolique par les levures

Récupération uniquement de la mie de pain riche en amidon substrat de la fermentation alcoolique par les levures

La croûte du pain n'est pas utilisée car elle contient des agents inhibiteurs de la fermentation alcoolique

Mélange Pain + Saccharomyces cerevisiae ( levure de boulanger ) près à être incuber pour 3 semaines à 30°C

Mesure du volume de la culture de Kluveromyces marxianus à ajouter dans une grande éprouvette

4ème Mélange: topinambour + pain + Kluveromyces marxianus et Torulopsis rubra

LE PROJET : Tri sélectif au self en janvier

Récupération du composte obtenu à partir du traitement des déchets biodégradables du self

Le compostage, Comment ça marche ?

Le compostage est "un processus par lequel des matériaux biodégradables sont mis ensemble pour être convertis en un amendement humifère stabilisé, grâce au travail d'organismes biologiques vivants sous conditions contrôlées."

Le compostage est un processus naturel ! Les dizaines d'espèces de micro-organismes et de petits animalcules se développent par millions sur les déchets organiques en se nourrissant de sucres, de protéines, de cellulose et d'autres constituants des matières organiques. Le but des méthodes de compostage est d'optimiser les techniques afin que les différentes vagues de micro-organismes se développent dans des conditions favorables et dans des délais raisonnables.

		nombre de levure à t 0	nombre de levure maximum pendant croissance	différence entre N t0 et N max
Saccharomyces cerevisiae	amidon T°30°C	6,7.10⁶	1,0.10⁷	3,3.10⁶
	inuline T°30°C	1.2.10⁷	2,0.10⁷	8,0.10⁶
	amidon T°ambiante	6,9.10⁶	9,7.10⁶	2,8.10⁶
	Inuline T°ambiante	1,1.10⁷	1,6.10⁷	5,0.10⁶

		nombre de levure à t 0	nombre de levure maximum pendant croissance	différence entre N t0 et N max
Kluveromyces marxianus	amidon T°30°C	4,4.10⁶	2,4.10⁷	2,0.10⁷
	inuline T°30°C	2.4.10⁶	1,2.10⁷	9,6.10⁶
	amidon T°ambiante	5,3.10⁶	1,2.10⁷	6,7.10⁶
	Inuline T°ambiante	1,1.10⁷	1,7.10⁷	6,0.10⁶
	amidon T°32°C	6,7.10⁶

		nombre de levure à t 0	nombre de levure maximum pendant croissance	différence entre N t0 et N max
Kluveromyces lactis	amidon T°30°C	8,1.10⁶	1,5.10⁷	6,9.10⁶
Kluveromyces lactis	inuline T°30°C	1,4.10⁷	3,3.10⁷	1,9.10⁷

		nombre de levure à t 0	nombre de levure maximum pendant croissance	différence entre N t0 et N max
*Torulopsis rubra*	amidon T°30°C	3,7.10⁶	2,3.10⁷	1,9.10⁷
	inuline T°30°C	9,9.10⁶	2,6.10⁷	1,6.10⁷
	amidon T°32°C	3,3.10⁶	8,8.10⁶	5,5.10⁶
	inuline T°32°C	7,5.10⁷	3,0.10⁷	2,3.10⁷

		nombre de levure à t 0	nombre de levure maximum pendant croissance	différence entre N t0 et N max
K. marxianus et S. cerevisiae	amidon et inuline T°30°C	6,5.10⁶	2,2.10⁷	1,6.10⁷
	amidon et inuline T°32°C	5,1.10⁶	1,4.10⁷	8,9.10⁶
	amidon et inuline T°ambiante	4,0.10⁶	5,3.10⁶	1,3.10⁶

MISE AU POINT DU TP DE CO-FERMENTATION DU TOPINAMBOUR ET DU PAIN POUR AUGMENTER LE RENDEMENT DE PRODUCTION EN Éthanol

Torulopsis rubra

FICHE Éthanol : Dosage éthanol par méthode UV

Blanc

LE PROJET : Tri sélectif au self en janvier

Le compostage, Comment ça marche ?

Révision : 08 juin 2009

éthanol à tant de pourcentage :	lecture Absorbance à 340 nm
100	0.593
50	0.496
25	0.367
12.5	0.286
6.25	0.231
témoin + à 0.08	0.132

Résultats DES DOSAGE DE L'Éthanol POUR LES DIFFÉRENTS Prélèvements DE MOUt DE FERMENTATION GROUPE 2
	Prélèvement du 27/11/07 : 2 semaines de fermentation		Prélèvement du 05/12/07 : 3 semaines de fermentation		Prélèvement du 11/12/07 : 4 semaines de fermentation
	Dosage par G2	Dosage par G1	Dosage par G2	Dosage par G1	Dosage par G1
KM +TOPI	0.532	0.536	(1.070)	0.592	1.113
KM +PAIN	0.083	0.128	0.120		0.109
SC + PAIN	0.122	0.111	0.101	0.129	0.119
KM+SC+PAIN +TOPI	0.087	0.134	0.297	0.274	0.397

Résultats DES DOSAGE DE L'Éthanol POUR LES DIFFÉRENTS Prélèvements DE MOUt DE FERMENTATION GROUPE 1
	Prélèvement du 12/12/07 : 1 semaine de fermentation	Prélèvement du 19/12/07 : 2 semaine de fermentation
KL + TOPI	0.103
KL + PAIN	0.136
TR + TOPI	0.601
SC + KM + KL + PAIN	0.133
TOUTES LES SOUCHES + TOPI + PAIN	0.215